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當(dāng)前位置:首頁(yè)技術(shù)文章質(zhì)粒提取濃度低的原因

質(zhì)粒提取濃度低的原因

更新時(shí)間:2025-08-18點(diǎn)擊次數(shù):88
 質(zhì)粒提取濃度低?6大核心原因+解決方案避坑指南的知識(shí)干貨,分享給每位同學(xué)~

一、質(zhì)粒濃度低直接后果:實(shí)驗(yàn)全線崩潰!

當(dāng)質(zhì)粒濃度<50 ng/μL時(shí):

1. 轉(zhuǎn)化失敗率↑ 300%

2. 測(cè)序信號(hào)弱(峰圖碎裂)

3. 酶切/連接效率暴跌

立即排查以下6大關(guān)鍵環(huán)節(jié)!

二、質(zhì)粒濃度低的6大核心原因 + 破解方案

原因1:菌體量不足(占比~35%

錯(cuò)誤操作:
? OD???0.6 收菌 菌數(shù)太少
? 離心轉(zhuǎn)速<6000g → 菌體丟失

解決方案:

收菌標(biāo)準(zhǔn):OD???=0.8-1.0(對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期)

離心參數(shù):≥ 12,000g × 2min(確保菌體沉淀緊密)

自檢工具:菌泥體積應(yīng)達(dá) 1.5-2ml/L培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基)

原因2:裂解不徹*(致命環(huán)節(jié)!)

裂解失敗標(biāo)志:溶液粘稠拉絲(基因組DNA污染)

高頻錯(cuò)誤:

錯(cuò)誤操作

正確方案

裂解時(shí)間>5min

≤4min(強(qiáng)振蕩混勻60s

未使用RNase A

添加終濃度100μg/ml RNase

裂解液溫度<20℃

預(yù)熱至室溫(25℃

原因3:結(jié)合/洗脫效率低(柱膜法專屬)

硅膠柱關(guān)鍵參數(shù):

 

問題環(huán)節(jié)

優(yōu)化方案

結(jié)合pH偏離

加中和液后pH=7.0-7.5(試紙監(jiān)測(cè))

膜堵塞

離心前不過(guò)濾裂解液(避免雜質(zhì)堵膜)

洗脫液未預(yù)熱

60℃預(yù)熱的ddH?OEB緩沖液

洗脫體積過(guò)大

≤50μl(分兩次洗脫合并)

原因4:質(zhì)粒拷貝數(shù)低(質(zhì)粒自身問題)

低拷貝質(zhì)粒示例:

pBR32215-20 copies/cellVS pUC500-700 copies/cell

破解策略:

添加 拷貝數(shù)增強(qiáng)劑(如氯霉素用于pBR系列)

更換 高拷貝載體(如pET-28a, pGEX

原因5:試劑盒性能缺陷(省錢反誤事)

劣質(zhì)試劑盒4大罪狀:

硅膠膜載量<20μg(大提質(zhì)粒崩潰)

溶菌酶活性不足(針對(duì)革蘭陽(yáng)性菌)

乙醇?xì)埩魧?dǎo)致酶失活

內(nèi)毒素污染(影響轉(zhuǎn)染)

選型黃金標(biāo)準(zhǔn):

參數(shù)

要求

載量

≥50μg(中提)

內(nèi)毒素

0.1EU/μg

洗脫濃度

≥150ng/μl(實(shí)測(cè)值)

原因6:樣本儲(chǔ)存/操作失誤

DNA降解:

? 反復(fù)凍融>3→ 濃度折半!

? -20℃儲(chǔ)存>6個(gè)月 斷裂成小片段

拯救方案:

分裝儲(chǔ)存于-80℃(可保存2年)

溶解時(shí)用TE緩沖液(EDTA抑制DNase

三、質(zhì)粒解決方案:全流程優(yōu)化表

步驟

操作標(biāo)準(zhǔn)

質(zhì)控點(diǎn)

培養(yǎng)

37℃ 220rpm ×16h

OD???=0.8-1.0

裂解

輕柔顛倒混勻×8

溶液透明無(wú)粘稠

中和

冰浴5min

pH試紙檢測(cè)7.0±0.5

過(guò)柱

離心≤10,000g ×1min

液體穿透

洗脫

60℃預(yù)熱液靜置2min

回收率>85%

濃度自檢:A???/A???=1.8-2.0(純度合格)

聯(lián)系方式

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